高效液相色譜是一種分析化學技術，用于分離、鑒定和定量混合物中的每種成分。它依靠泵使含有樣品混合物的加壓液體溶劑通過裝有固體吸附材料的色譜柱。樣品中各組分與吸附材料的相互作用略有不同，導致流速不同，從而導致組分在離開色譜柱時發生分離。高效液相色譜法已被用于制造(藥物和生物制品的生產過程)、法律(檢測尿液中的增強性能藥物)、研究(分離復雜生物樣品或合成化學品的成分)和醫療(檢測血清中的維生素D水平)。高效液相色譜法最初是為了分析光合微生物(包括藍藻和藻類)分泌的有機酸而開發的，但也可以用于分析任何在液體培養基中培養的微生物分泌的有機酸。


　　A.試劑和制備


　　試劑


　　藍細菌，聚球藻屬。


　　液體培養(藍細菌或其他微生物)


　　8 mM  H2SO4:將0.898 ml  H2SO4 (98%)溶解在1000 ml  dH2O中。使用0.45米過濾裝置進行過濾。


　　50 mM琥珀酸酯原液：將14.76 mg琥珀酸酯溶于25 ml  dH2O中。儲存在-20攝氏度。


　　50 mM  -酮戊二酸原液：將18.26 mg  -酮戊二酸溶于25 ml  dH2O中。儲存在-20攝氏度。


　　50 mM醋酸原液：將71.4l醋酸溶解在25 ml  dH2O中。儲存在-20攝氏度。


　　50 mM丙酮酸鹽儲備溶液：將88.65l丙酮酸鹽(98%)溶解在25 ml  dH2O中。儲存在-20攝氏度。


　　50mm-酮異己酸酯原液：154.19 l-酮異己酸酯(


　　98%)溶解在25毫升dH2O中。儲存在-20攝氏度。


　　10 mM有機酸標準混合物：將2 ml上述五種50 mM有機酸標準混合，得到10 mM混合有機酸溶液(最終體積10 ml)。將混合有機酸溶液串聯稀釋以產生適于構建標準曲線的濃度范圍；例如，5 mM、2 mM、1 mM、0.5 mM、0.25 mM、0.1 mM.標準曲線的濃度范圍應涵蓋在細胞外樣品中測量的濃度范圍。儲存在-20攝氏度。


　　裝備


　　微型離心機


　　Surveyor  Plus  HPLC包括Surveyor  LC泵、Surveyor自動進樣器、Surveyor光電二極管陣列(PDA) Plus檢測器和Surveyor折射率(RI) Plus檢測器Aminex發酵監測柱(150mm7.8mm)，固定相聚苯乙烯-二乙烯基苯磺酸樹脂，9微米粒度，8%交聯


　　微保護陽離子氫濾筒保護柱，30 x  4.6毫米，氫型，酸堿度范圍1-3，用于Aminex氫型柱


　　Chromquest軟件和chromquest軟件平臺


　　樣品制備


　　使用移液管，從液體培養物中取出2 ml等分試樣，置于2 ml  Eppendorf管中，并以13，000 xg離心10分鐘以沉淀細胞。


　　上清液是含有分泌的有機酸的細胞外介質，被除去并保留。此時，上清液可在-20下冷凍，用于隨后的高效液相色譜分析，或如以下步驟所述立即分析。


　　使用1毫升一次性注射器和孔徑為0.45米的過濾器，將500-700升樣品上清液過濾到色譜瓶中，以去除可能干擾有機酸檢測的顆粒，并堵塞數值和線路。對用于構建標準曲線的每個有機酸標準樣品重復上述步驟。關上藥瓶。這些現已準備好進行高效液相色譜分析。


　　B.程序


　　8毫摩爾H  2 SO  4用作等度洗脫的流動相。


　　使用Chromquest軟件將色譜柱溫度升至35，然后升至45(使用0.1毫升分鐘-1的流動相流速)。將折射率檢測器設置為50.


　　色譜柱達到45后，下載具有以下設置的樣品測量方法。這些設置是發酵監測柱的標準方案，唯一的優化是增加運行時間，以確保樣品完全從柱中洗脫出來。


　　等待10分鐘使基線穩定，將樣品瓶放入自動進樣器托盤，為您的操作創建一個新的序列文件，自動將PDA  Plus和RI檢測器歸零，然后開始操作。


　　步驟3中的設置


　　研究者LC泵：總流量，0.5毫升/分鐘；壓力極限，0-1100磅/平方英寸；運行時間，40分鐘。


　　測量員PDA  Plus:運行時間，40分鐘；掃描，200-360 nm，掃描速率，1.0hz帶寬1納米。


　　測量員：注入量，25升；從針到底部的高度，2.0毫米；注射器速度，8 l秒-1；沖洗速度，70升秒-1；沖洗量，500升；洗滌量，300升；沖洗/洗滌源，8 mM  H2SO4流動相；將托盤溫度設置為10；讓烤箱控制的溫度達到45.測量員RI  Plus:運行時間，40分鐘；數據速率，10hz；溫度控制設置為50.


　　數據分析


　　PDA  Plus檢測器和RI檢測器產生的典型色譜圖如下所示。


　　Chromquest軟件用于整合和量化每個有機酸峰下的面積。


　　通過繪制峰面積和已知濃度之間的關系，為每種有機酸創建了標準曲線。


　　使用標準曲線計算上清液樣品中每種有機酸的濃度。這將給出細胞外介質中有機酸的濃度。數據可以標準化為細胞計數，以確定每個細胞分泌的有機酸量。