液相色譜是一種成熟的物質分離技術。高效液相色譜是一種適用于廣泛應用的分析方法。在這里，我們描述了高效液相色譜的原理，并介紹了高效液相色譜系統最重要的組成部分和決定測量成功的因素。


　　高效液相色譜原理

　　高效液相色譜的分離原理是基于分析物(樣品)在流動相(洗脫液)和固定相(色譜柱填料)之間的分布。根據分析物的化學結構，分子在通過固定相時會發生延遲。樣品和填充材料之間特定的分子間相互作用決定了它們的“加載時間”。因此，樣品的不同成分在不同的時間洗脫。從而實現樣品成分的分離。

　　檢測單元，例如紫外檢測器，在離開色譜柱后識別分析物。信號由數據管理系統(計算機軟件)轉換和記錄，然后顯示在色譜圖中。在通過檢測器單元后，流動相可以經受額外的檢測器單元、餾分收集單元或廢物處理。通常，高效液相色譜系統包括以下模塊：溶劑容器、泵、進樣閥、色譜柱、檢測器單元和數據處理單元(圖1)。溶劑(洗脫液)以高壓和恒速泵送通過系統。為了盡可能減少探測器信號的漂移和噪聲，泵的恒定無脈沖流量非常重要。分析物(樣品)通過進樣閥提供給洗脫液。


　　梯度與等度

　　根據流動相的組成，通常有兩種不同的模式。如果流動相的組成在分離過程中保持不變，高效液相色譜系統被定義為等度洗脫系統。當流動相組成在分離過程中發生變化時，高效液相色譜系統被定義為梯度洗脫系統。對于梯度系統，可以使用兩種不同的技術：低壓梯度(LPG)和高壓梯度(HPG)。低壓梯度意味著溶劑的混合發生在泵的上游(吸入側)。在高壓梯度系統中，不同的溶劑由單獨的泵供應，并在泵后混合(排出側)。[1]圖2示出了LPG和HPG梯度模式的示例性系統配置。


　　柱子

　　該色譜柱代表任何高效液相色譜系統的核心。它負責樣品成分的完全分離。分離效率與柱內徑、柱長、柱填料類型和粒徑有關。根據所需的應用，市場上有多種高效液相色譜柱。不同的填料支持不同的分離機制。——常用材料用于正相、反相、尺寸排阻、離子交換、親和、手性或親水相互作用HPLC。


　    探測器

　　檢測器單元的任務是記錄從色譜柱上洗脫的物質的時間和數量。檢測器檢測洗脫液成分的變化，將該信息轉換成電信號，并在計算機的幫助下對其進行評估。根據分析物的結構特征，可以使用多種檢測器。常見的檢測器單元有折射、紫外/可見、電化學和熒光檢測器。圖4示出了具有不同檢測器的兩種等度系統配置。

        色譜參數

　　檢測器單元將流動相輸送的分離分析物記錄為信號峰。所有峰的總量稱為色譜圖。每個單獨的峰提供分析物的定性和定量信息。定性信息由峰本身給出(例如形狀、信號強度、色譜中的時間)。此外，峰面積與物質的濃度成正比。因此，色譜數據管理軟件可以通過集成計算樣品濃度。這提供了定量信息。理想情況下，峰值記錄為高斯鐘形曲線。圖5示出了示意性示例。


　　延遲時間(t0)

　　延遲時間是指將未延遲的化合物從注射點轉移到檢測器單元(記錄化合物的位置)所需的時間。在此期間，所有樣品分子僅位于流動相中。通常，所有樣品分子共享相同的延遲時間。分離是由于物質和固定相之間的粘附力不同造成的。


　　保留時間(tR)

　　保留時間是指化合物從注射到檢測所需的時間。因此，它代表分析物處于流動相和固定相的時間。保留時間因物質而異，應始終在相同條件下提供相同的值。


　　峰值寬度(w)

　　峰值寬度涵蓋了檢測器信號反復下降后從信號斜率開始到基線的時間段。

　　拖尾因子(t)

　　事實上，完全對稱的峰非常罕見。在色譜圖中，它們通常顯示一定程度的拖尾。峰值拖尾通過拖尾因子T來測量.這個因子描述了峰的不對稱性，即形狀接近完美對稱高斯曲線的程度。拖尾因子的測量如下：T=b/aa代表峰的前半部分的寬度，b是峰的后半部分的寬度。這些值是在峰高的10%處測量的，從峰的前緣或后緣到從峰點垂直下降的直線(見圖5)。[4] T=1代表對稱峰。為了t1、峰值輪廓稱為拖尾。對于T  1，峰值輪廓稱為前沿。