離子色譜儀是根據離子與固定相和流動相的相互作用來分離離子的儀器。這些相在吸引陰離子的陰離子柱和吸引陽離子的陽離子柱之間是不同的。每個色譜柱只能測量它所吸引的特定類型離子的電導率。離子會根據對特定樹脂的親和力，以不同的速度通過離子色譜儀的色譜柱，根據離子電荷和大小的不同，相互分離。洗脫液通過色譜柱時，對樹脂親和力較弱的離子會較快通過色譜柱，首先被洗脫，而對色譜柱親和力較強的離子會較慢通過色譜柱。


　　離開色譜柱后，離子被電導檢測器測量。檢測器將生成色譜圖，并繪制電導率和時間之間的關系。每個離子在圖上產生一個峰，其高度取決于注入溶液中的相對離子濃度。這些測量可用于確定未知樣品中分析物的濃度。為了消除流動相中離子可能造成的干擾，可以在電導率測量前使用抑制器去除不必要的電解質。當溶液通過抑制器時，洗脫液中的離子被非離子物質取代。


　　影響分離的參數包括：

　　色譜柱——因為高分子樹脂的孔隙率和大小會影響分離度，所以要選擇合適的色譜柱才能達到良好的分離。較小的粒徑可以提高分辨率，但會增加系統的背壓。例如，填充有大尺寸珠子的柱用于蛋白質純化的早期階段，而較小的珠子用于流速較慢的最終純化。


　　緩沖液——用作陽離子交換色譜流動相的典型緩沖液包括甲酸鹽(3.8)、乙酸鹽(4.6)、MES  (6.1)、磷酸鹽(7.2)或tris  (8.1)，而用作陰離子交換色譜流動相的緩沖液包括tris、哌嗪(9.7)和二乙胺(11)。為IEX選擇緩沖液時，請記住pka值(在括號中提供)。為了保持所需的pH值，緩沖溶液的濃度通常應在2050mm的范圍內


　　緩沖液pH-對于陽離子交換色譜，洗脫緩沖液的pH保持在4-7的范圍內，對于陰離子交換，pH保持在7-11的范圍內。所選的pH值必須支持目標分析物與固定相的結合，并且應接近其pI值，以便其可以從色譜柱中釋放出來。在非常低或非常高的pH值下，分析物，尤其是蛋白質，可能會牢固地結合到固定相上，這需要高鹽濃度來洗脫。此外，一些蛋白質可能在高pH值和高鹽濃度下沉淀或失去活性。對于陰離子交換和陽離子交換色譜，起始緩沖液的pH值應分別高于或低于目標分析物的pI  0.5至1 pH單位。必須仔細優化起始緩沖液的濃度，以確保有效分離。離子強度/鹽濃度-通常用含有高達300至500 mM鹽(如氯化鈉、氯化鉀、溴化鈉、硫酸鈉或乙酸鈉)的緩沖液進行洗脫。


　　添加劑——如有必要，可添加尿素、糖或去污劑等添加劑，以增加分析物的溶解度，防止其沉淀或通過抑制酶活性來確保分析物的穩定性。然而，添加劑可能在工作pH值下帶電，從而干擾分離。


　　樣品制備-由于緩沖液的pH值決定了分子的電離狀態，因此樣品緩沖液的pH值保持在高于或低于目標分析物pI值0.5至1.5個pH單位。這確保了分子對于陰離子交換或陽離子交換色譜是適當帶電的。雖然緩沖液的選擇取決于樣品基質，但起始緩沖液最適合樣品制備。如果使用不同的緩沖液，可以在分析前將其與起始緩沖液交換。高離子強度溶液中的樣品可以在裝載前用起始緩沖液稀釋，只要它不含污染物，如洗滌劑。粘性樣品難以取樣和分離；這些必須用起始緩沖液稀釋。除pH值外，樣品緩沖液的離子強度對獲得良好的分離度也起著重要作用。因此，有必要對樣品進行脫鹽處理，并用起始緩沖液替換其緩沖液。在將樣品裝入色譜柱之前，必須過濾樣品以去除顆粒。


　　上樣-為了獲得最佳分離度，分析物的質量不應超過制造商推薦的色譜柱的結合能力。

　　梯度必須優化運行時間和離子強度隨時間變化的百分比，以達到所需的分離度。一般來說，階梯式pH梯度優于線性pH梯度，因為后者難以精確和重復地產生。

　　——分辨率不受影響的最高流速可用于提高通量。在色譜柱再生和再平衡過程中，可以使用更高的流速以節省時間。

　　雖然IEX有幾個優點，但它也有一些局限性(表2)，在選擇該技術進行生物分子的分離、純化或定量時必須考慮這些因素。