生物技術研究的一個重要組成部分是使用蛋白質工程技術來設計或修飾蛋白質。這些蛋白質純化技術優化了特定工業應用的蛋白質特性。




這些技術要求科學家分離和純化感興趣的蛋白質，以便研究它們的構象和底物特異性。同樣需要研究的是與其他配體（一種與受體蛋白相連的蛋白質）的反應和特定的酶活性。




所需的蛋白質純度取決于蛋白質的預期最終用途。對于某些應用，粗提取物就足夠了。其他用途，例如在食品和藥品中，需要高純度。幾種蛋白質純化技術用于達到所需的純度水平。


制定戰略
每個蛋白質純化步驟通常會導致一定程度的產品損失。因此，理想的蛋白質純化策略是以最少的步驟達到最高水平的純化。


選擇使用哪些步驟取決于目標蛋白質的大小、電荷、溶解度和其他特性。以下技術最適合純化單個胞質蛋白。


胞質蛋白復合物的純化更為復雜，通常需要應用不同的方法。


準備粗提物
純化細胞內（細胞內）蛋白質的第一步是制備粗提取物。提取物將包含來自細胞質的所有蛋白質的復雜混合物，以及一些額外的大分子、輔因子和營養素。




這種粗提物可用于生物技術中的某些應用。但是，如果純度是一個問題，則必須遵循后續的純化步驟。粗蛋白提取物是通過去除細胞裂解產生的細胞碎片來制備的，這是使用化學品、酶、超聲處理或法式壓濾器實現的。


從提取物中去除碎片
通過離心去除碎片，并回收上清液（固體殘留物上方的液體）。細胞外（細胞外）蛋白質的粗制品可以通過離心去除細胞來獲得。




對于某些生物技術 應用，需要耐熱酶——可以耐受高溫而不變性，同時保持高比活性的酶。


產生耐熱蛋白質的生物有時被稱為極端微生物。純化耐熱蛋白質的一種簡單方法是通過加熱使混合物中的其他蛋白質變性，然后冷卻溶液（從而使耐熱酶在必要時重新形成或重新溶解）。然后可以通過離心去除變性的蛋白質。


中間蛋白純化步驟
現代生物技術 協議通常利用許多市售的試劑盒或方法，為標準程序提供現成的解決方案。蛋白質純化通常使用過濾器和準備好的凝膠過濾柱進行。


按照透析試劑盒的說明，添加正確體積的正確溶液并等待指定的時間，同時在新試管中收集洗脫液（通過色譜柱的溶劑）。




使用色譜方法
可以使用臺式色譜柱或自動 HPLC 設備應用色譜方法。HPLC 分離可以通過反相、離子交換或尺寸排阻方法完成，樣品通過二極管陣列或激光技術檢測。


使用降水
過去，從粗提物中純化蛋白質的常見第二步是在具有高滲透強度的溶液（即鹽溶液）中沉淀。蛋白質沉淀通常使用硫酸銨作為鹽進行。通過沉淀與硫酸鏈霉素或硫酸魚精蛋白形成的聚集體，可以去除粗提取物中的核酸。


鹽沉淀通常不會產生高度純化的蛋白質，但可以幫助消除混合物中一些不需要的蛋白質，并通過濃縮樣品。然后通過多孔纖維素管滲析、過濾或凝膠排阻色譜去除溶液中的鹽。


不同的蛋白質會在不同濃度的硫酸銨中沉淀。通常，較高分子量的蛋白質在較低濃度的硫酸銨中沉淀。


蛋白質可視化和純化評估
反相色譜 (RPC) 根據蛋白質的相對疏水性（從水中排除非極性分子）來分離蛋白質。該技術具有高度選擇性，但需要使用有機溶劑。


一些蛋白質會被溶劑永久變性，并在 RPC 過程中失去功能。因此，不建議將這種方法用于所有應用，尤其是在目標蛋白需要保持活性的情況下。


離子交換
離子交換層析是指基于電荷的蛋白質分離。色譜柱可以用于陰離子交換或陽離子交換。陰離子交換柱包含一個帶有正電荷的固定相，可以吸引帶負電荷的蛋白質。 


陽離子交換和凝膠過濾
陽離子交換柱是相反的、帶負電的珠子，可以吸引帶正電的蛋白質。目標蛋白質的洗脫（從另一種物質中提取一種物質）是通過改變柱中的 pH 值來完成的，這會導致每種蛋白質的帶電官能團發生變化或中和。


體積排阻色譜
尺寸排阻色譜（也稱為凝膠過濾）將較大的蛋白質與較小的蛋白質分開，因為較大的分子在色譜柱中通過交聯聚合物的速度更快。大的蛋白質不適合聚合物的孔，而較小的蛋白質則適合，并且需要更長的時間通過較少直接的路徑通過色譜柱。


洗脫時間
洗脫液（洗脫的結果）收集在一系列根據洗脫時間分離蛋白質的管中。凝膠過濾是濃縮蛋白質樣品的有用工具，因為收集的目標蛋白質的洗脫體積比最初添加到柱中的洗脫體積更小。類似的過濾技術可以用于大規模蛋白質生產，因為它們具有成本效益。


親和色譜和電泳
親和層析是一種非常有用的“拋光”技術，或完成蛋白質純化過程。色譜柱中的珠子與與目標蛋白特異性結合的配體交聯。


然后通過用含有游離配體的溶液沖洗將蛋白質從柱子中除去。與其他技術相比，此方法可提供最純凈的結果和最高的比活度。


SDS-PAGE
SDS-PAGE（用于聚丙烯酰胺凝膠電泳的十二烷基硫酸鈉）與蛋白質結合，賦予它們大量的凈負電荷。由于所有蛋白質的電荷相當相等，因此這種方法幾乎完全根據大小將它們分開。


SDS-PAGE 通常用于在一系列的每個步驟之后測試蛋白質的純度。隨著不需要的蛋白質從混合物中逐漸去除，在 SDS-PAGE 凝膠上可視化的條帶數量減少，直到只有一個條帶代表所需的蛋白質。


免疫印跡
免疫印跡是一種與親和色譜結合應用的蛋白質可視化技術。特定蛋白質的抗體用作親和層析柱上的配體。


目標蛋白保留在柱子上，然后通過用鹽溶液或其他試劑沖洗柱子來去除。一旦目標蛋白與混合物的其余部分分離，與放射性或染料標記相連的抗體有助于檢測目標蛋白。