它是血漿生物分析中常見的基質。但血漿中的磷脂在ESI-MS檢測時會導致一系列分析問題，如背壓升高、儀器維護需求增加以及以離子抑制形式出現的基質效應等，離子抑制會導致色譜操作過程中出現其他問題，如結果不可重現、信號強度損失、定量不佳等。在本應用簡報中，討論了Microlute  PLR  96孔板的應用，表明在去除磷脂以消除其在分析中引起的問題的同時，可以獲得高的可重復回收率。


　　它是研究血漿藥物代謝和藥代動力學(DMPK)的重要基質，廣泛用于生物分析。對于DMPK的藥物開發，通常通過液相色譜-質譜(LC-MS)來篩選不同的化合物并評估其特性。為了將液相色譜-質譜聯用技術應用于藥物開發和分析，有必要在將樣品注入系統之前對其進行純化，以消除血漿中的干擾，從而獲得可靠和一致的結果。


　　血漿的純化可以在分析前以幾種不同的方式進行。最簡單的制備方法是蛋白質沉淀法。這個過程包括加入有機溶劑，“鹽析”或調節血漿溶液的酸堿度，然后導致蛋白質從溶液中沉淀出來。這是一種快速簡單的方法，用于制備溶液，防止蛋白質注入色譜儀器時影響下游應用。然而，這種制備技術不會從樣品中去除磷脂，這將導致許多并發癥并影響結果。


　　磷脂是一種脂質，含有一個磷酸頭和至多兩個脂肪酸衍生的尾。這使它們兩親。——極性磷酸鹽的頭部提供親水性，尾部負責疏水性。磷脂是細胞膜的主要成分，所以在整個人體內無處不在。最常見的磷脂類型是甘油磷脂(主要由甘油磷脂酰膽堿組成)、溶血磷脂和鞘脂，它們占總磷脂的70%(甘油磷脂)、10%(溶血磷脂)和10-20%(鞘脂)。


　　在這些磷脂中，有幾種常見的磷脂亞類——磷脂酸(PA)、磷脂酰膽堿(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰絲氨酸(PS)和鞘磷脂。


　　眾所周知，液相色譜-質譜方法中常用的反相色譜柱(如C8和C18)會因注入色譜柱的樣品中的磷脂而縮短色譜柱的壽命。當色譜柱上的疏水官能團與磷脂的疏水尾相互作用時，就會發生這種情況。通常情況下，一些磷脂可能與色譜柱的固定相結合，導致色譜柱的保留容量降低，系統背壓增加，色譜柱以隨機間隔緩慢流失。可以包含在高有機沖洗中以防止這種情況的發生，但是這將增加分析方法已經很長的時間。磷脂也已知會引起離子抑制。當干擾化合物與被分析物同時從高效液相色譜柱中流出時，這發生在質譜儀源中。共洗脫分子，如磷脂，可以與目標分析物競爭源中的可用電荷，導致更少的分析物被離子化。這將降低分析物的強度，因此會發生信號抑制。磷脂還會影響進入源頭的溶劑液滴的蒸發。降低液滴的揮發性可能會增加半徑，減少表面積和電荷，從而降低分析物信號的整體強度[3，7]。


　　固相萃取是制備血漿樣品時去除磷脂的常用方法。清洗步驟可以去除樣品中的干擾化合物，并允許洗提更清潔的溶液，以便直接注射到所選系統中，或者干燥并重新配制成合適的溶劑混合物。盡管固相萃取有其優勢，但開發一種有效且可重復的去除蛋白質和磷脂的方案可能非常耗時。


　　Lute  PLR產品專門設計用于在液相色譜-質譜分析前去除血漿中的蛋白質和磷脂。它提供了一種更快、更簡單的方法，可以有效去除血漿中的蛋白質和磷脂，制備注射樣品。


　　與其他樣品制備技術相比，該方法的優勢在于開發運行等離子體樣品的方法的速度和簡單性。該方法的開發非常簡單，只需用水稀釋粘性樣品或在蛋白質分解步驟中調整有機溶劑的體積即可。與固相萃取相比，微萃取PLR去除磷脂為該方法的開發提供了一種更快、更簡單的方法，從而以更少的人工操作時間實現更高的通量。


　　本應用程序討論了人、牛、豬和大鼠血漿來源中磷脂的差異，特別是每種類型中磷脂的組成。并且使用Microlute  PLR  96孔板(PPLR025P-001)來分析分析物的回收率并去除每種不同的磷脂。這些來源來自DMPK研究中常用的三種——人、嚙齒動物(大鼠)和非嚙齒動物(牛和豬)。在這里，我們證明，盡管血漿來源不同，但仍然可以實現可重復的回收和磷脂去除。


　　實驗

　　本應用簡報中測試的化合物由兩種酸性、堿性和中性分析物組成。這測試了產品的靈活性，以提供獨立于化合物分類的良好回收結果。化合物之間存在一系列疏水性，從氫化可的松的1.61到阿米替林的4.92，以測試分析物的疏水性對回收率的影響。


　　樣品制備方法

　　在本申請中，選擇人、豬、牛和大鼠血漿。所有血漿都來自適馬-奧爾德里奇。對于每種不同的血漿類型，一定體積的血漿被加標至濃度為1。5 g/ml并平衡30分鐘。將100升每種加標血漿樣品加入到板的六個孔中，并將100升每種類型的空白血漿僅加入到一個孔中作為基質匹配標準。將所有血漿樣品與300升含1%甲酸的乙腈溶液混合，移液四次，以確保兩種溶液完全混合。用5磅/平方英寸的正壓將破碎的血漿溶液洗脫到1毫升收集板(編號219250)中，直到孔完全排空。將收集板中制備的溶液直接注入液相色譜-質譜系統，并使用表2和3中列出的條件進行分析。


　　結果和討論

　　色譜顯示了該方法的色譜圖，僅顯示了分析物峰。整個過程沒有主干擾峰。由于從收集板注入75%乙腈溶液，早期洗脫峰略有拖尾。這可以通過用水稀釋或干燥并在洗脫強度較低的溶液中重構來改善。出于本申請的目的，沒有進行該操作，因為液相色譜方法顯示出良好的注射重現性，并證明其可以快速塌陷、洗脫和注射到系統中，并獲得高且可重現的回收率。


　　色譜顯示了使用蛋白質沉淀樣品的方法的磷脂峰。這些峰分離得很好，大多數沒有干擾。豬血漿在34:1 SM峰有一個肩峰，可能是異構體的存在。因為使用單個四極桿儀器，這些異構體無法分離。


　　血漿比較

　　本應用筆記主要關注血漿中常見的六種不同磷脂-16:0 LPC、1833600LPC、3433601sm、3433602pc、3633602pc和3833604pc。這些范圍從16:0 LPC的LogP  5.6到3833604 PC的14.1[9]。由于疏水性低，短鏈磷脂(1633600和18:0 LPC)最有可能與分析物共流動。長鏈磷脂更有可能粘附在高效液相色譜柱上和/或以不規則的間隔洗脫，導致意想不到的峰和基質效應。


　　對于這種應用，顯示每個樣品中每個磷脂含量的相對差異是有用的。表4顯示了每種蛋白質沉淀血漿樣品中磷脂的不同相對組成，繪制的值用于圖6中的比較。根據這些值，每個不同血漿樣品的成分可以相互比較。


　　這有助于解釋去除不同磷脂的困難，它們干擾電離的可能性，或者它們是否更有可能導致液相色譜柱上的堆積問題。例如，疏水性較低的磷脂含量較高(16:0或18:0 LPC)表明，它不太可能導致液相色譜柱堆積，但更有可能被分析物洗脫。另一方面，疏水磷脂含量高的相反情況可能最終導致它們與液相色譜柱結合。磷脂去除


　　磷脂的去除是生物分析中的一個重要考慮因素，因為它具有以下優點:

　　因為減少了基質效應，這導致了該方法更高的重現性。可重現性方法意味著待測樣品較少，因此我們對分析結果有信心。

　　由于減少了離子抑制，該方法更加靈敏。這允許在分析過程中使用更少的樣本。

　　通過減少吸附在固定相上的磷脂延長色譜柱壽命。

　　減少污染的基質成分進入源頭，最大限度地減少維護停工時間。


　　表5顯示了每個測試血漿樣品的磷脂去除率。去除所有高度疏水的磷脂。對于這兩種溶血磷脂，豬和人血漿的去除率最低，為99.4%。通過用表4中分析的磷脂組成對每次去除進行加權來計算總磷脂去除量。該數據表明，四個樣品中的每一個都實現了磷脂去除。


　　回收率

　　圖7中顯示了經微量plr  96孔板處理的每個血漿中分析物的回收率。繪制的每個值是注入液相色譜-質譜系統的六個重復的平均回收率。分析物是一系列疏水性酸性、堿性和中性化合物的混合物——化合物詳情見表1。所有回收率均大于90%，表明Microlute  PLR非常有效且重現性好，可以在不影響磷脂去除的情況下獲得較高的回收率。


　　再現性

　　孔隙再現性是提供數據可靠性的重要指標。%RSD值越低，結果的重現性越好。當驗證方法時，色譜分析方法通常有10-15%相對標準偏差極限的指導方針。


　　顯示了可再現的數據。數據范圍從牛血漿中阿米替林的0.88%相對標準偏差到豬血漿中酮洛芬的5.74%相對標準偏差。數據顯示，四種血漿中每種分析物的重現性都符合藥物開發生物分析方法驗證過程中選擇的標準和典型的%相對標準偏差指南。


　　總結

　　Microlute  PLR  96孔板是一款使用方便、解決方案快捷的產品。它為一系列具有不同磷脂成分和特性(粘度和蛋白質含量)的血漿樣品提供完全的磷脂去除，而不影響分析物的回收率或重現性。