高效液相色譜是分析離子、蛋白質和有機分子的一種強有力的分離技術。高效液相色譜基于吸附、分配和離子交換機制，具體取決于所用固定相的類型。該技術包括固體固定相和液體流動相，它們通常封裝在不銹鋼柱中。感興趣的分子根據兩相之間溶質相對分配比的差異而被分離。高效液相色譜法被廣泛用于評估純度和確定潛在藥物分子的含量。它也可用于測定對映體組成，使用改良的流動相或手性固定相。


　　原則


　　高效液相色譜的工作原理是樣品的某些成分通過色譜柱的時間比其他成分長。分子花費的時間取決于分子與流動相(液體或氣體)和固定相(固體或液體)的親和力。那些與固定相有更大親和力的物質需要更長時間才能通過色譜柱，反之亦然。


　　工具


　　該裝置由泵送系統、進樣閥、色譜柱、固定相和流動相、連接管、檢測器和數據采集裝置組成。該泵用于確保以1.0毫升/分鐘的速度向分析柱提供可調、恒定和可再現的流速。注射器將可變且可再現的樣品體積的窄流引入分析柱的頂部。分析柱中分析物的最佳水平保持在可接受的壓降。該檢測器為系統檢測色譜柱信號提供了高靈敏度、線性度和長期穩定性。數據采集設備采集和存儲數據并進行計算。這些計算用于控制和調整操作參數和分離條件。


　　草案


　　流動相的制備


　　將400毫升乙腈加入約1.5升純去離子水中。


　　向該溶液中加入冰醋酸(2.4毫升)。


　　用純化的去離子水稀釋溶液，使容量瓶中的總體積為2.0 L。所得溶液的酸堿度應在2.8至3.2之間。


　　加入40%氫氧化鈉，調節pH值至4.2。


　　真空過濾流動相，去除溶液中可能堵塞色譜柱的氣體和固體。


　　組分溶液制備


　　根據待分離組分的要求制備樣品溶液。


　　開發標準解決方案


　　在一個50毫升的容量瓶中取適量的每種成分。


　　用流動相將儲備溶液稀釋至容量瓶上的50毫升標記。


　　將每個標準溶液倒入小瓶中。


　　將樣品和剩余溶液一起儲存在冰箱中。


　　檢查高效液相色譜系統的設置


　　確保廢物管線位于廢物容器中。


　　將流動相的流速設置為0.5毫升/分鐘。


　　將最小和最大壓力和流量設置為輸送泵前面板上的正確值。


　　將最小壓力設置為250磅/平方英寸。


　　將最大壓力設置為4，000磅/平方英寸。


　　按下檢測器前面板上的“零”，將其設置為純流動相。用去離子水沖洗100l注射器，然后用幾倍體積的待分析成分溶液沖洗，然后填充注射器。


　　取樣和數據收集


　　通過隔膜口在裝載位置緩慢注射100微升溶液和注射器手柄。


　　設置數據采集程序，采集數據300秒，通過檢測器得到三個要洗脫的峰。


　　開始測試前，將注射器手柄轉到注射位置，立即點擊計算機數據采集程序上的“開始測試”。


　　300秒后，數據采集器會發出保存數據文件的信號。


　　記錄每次測試的峰值時間(以秒為單位)，以識別每個組件。


　　從隔膜中取出注射器，并對每個剩余的工作標準執行該過程。


　　計算


　　計算樣品溶液中所有成分的濃度。


　　每個標準樣品和未知樣品的色譜峰面積通過三角測量確定，等于峰高乘以高度處的寬度


　　確定組件達到峰值所需的時間。


　　繪制所有組分的峰面積和濃度(毫克/升)的校準曲線。


　　計算校準曲線的最小二乘擬合。


　　優點和局限性


　　與其他色譜技術相比，高效液相色譜非常快速和高效。


　　該過程平均需要10到30分鐘，并提供高分辨率。它是一種高度精確和可重復的有機分子分離技術。


　　高效液相色譜只需要最低限度的培訓，包括自動化設備。


　　高效液相色譜是一種通用且極其精確的分析方法，用于識別和定量化學成分。


　　高效液相色譜的優點包括需要小樣本量，根據所需的定量水平進行修改，以及結果的可靠性。


　　盡管它有優點，但它可能很貴，需要大量昂貴的有機物。