高效液相色譜中最有用的診斷方法之一是檢測器在洗脫液流動時產生的基線的性質。雖然很多基線特征是常見的——，如漂移和非典型調節周期(脈動)——，但可以說基線噪聲更常見，可能來自各種來源。此外，根據儀器配置，了解什么是“正常”基線，而不是異常基線水平非常重要。


　　如何才能讓嘈雜的基線安靜下來？


　　高效液相色譜輸出的信噪比通常通過檢測器信號與固有背景信號的比值來測量。這是系統中“正常”噪聲的一個有用的度量。固有噪聲或背景噪聲通常在基線的預定義部分進行測量，大多數數據系統都可以進行這種測量并報告結果。


　　當系統中的固有噪聲或背景噪聲異常高時，會影響系統的性能，通常會導致定量限和可再現積分的增加。這就是為什么作為色譜學家，我們對高于預期的噪音水平如此緊張。


　　最小的可檢測信號通常被估計為相當于平均基線噪聲高度——的三倍，這將使得檢測器的“檢測極限”信噪比為：1。如果注入的分析物的量小于該值，則信號不再能與噪聲區分開。對于定量分析，建議“定量限”的信噪比(S/N)為1033601。


　　在計算檢測器靈敏度時，分析物信號——的大小不能單獨使用，即檢測靈敏度通常根據“信噪比”來定義，信噪比是分析物信號與基線變化之比的測量值。信噪比的測量通常由數據系統完成。


　　


　　當一種方法(或儀器)表現良好時，首先需要建立信噪比，最好是針對每種方法和一組儀器條件。也許這將擴展到確定系統適用性性能標準(通常是一個范圍或一個可接受的下限)。


　　當然，有經驗的色譜分析師可以通過查看基線來知道固有噪聲是否“正常”。但這只是經驗帶來的。還應注意在合理的屏幕放大率或信號衰減下評估噪聲，因為在正確的放大率下，任何基線都可能出現噪聲！


　　


　　然而，數據系統可能會通過報告所謂的峰峰值噪聲來再次幫助我們，該噪聲可以用吸光度單位來表示。這是正常基線部分變化的度量——，而不是信號高度的比率——，并且在確定背景噪聲的可接受極限時非常有用。大多數高效液相色譜檢測器將運行噪聲測試評估，作為其初始化程序的一部分。否則，他們可以使用美國材料試驗學會標準來測試長時間流過流動池的高效液相色譜級水。可接受的噪音水平規格將在制造商的說明書中給出。


　　雖然它通常與檢測器現象有關，但高效液相色譜結果中的噪聲有許多因素。我們現在只研究一些主要罪犯。根據問題根源的性質，噪聲可以是隨機的和周期性的。這種差異本身可以為我們提供一些關于問題本質的線索。


　　檢測器噪聲


　　電子和雜散光噪聲


　　每個探測器都有背景電子和雜散光噪聲，通過用絕緣材料屏蔽光學工作臺，可以將這些噪聲保持在最低水平。檢測器固件中的內置測試應保持在最低限度，如果這些測試在啟動時失敗，儀器將被標記。這是不時重啟檢測器電源的一個很好的理由，尤其是如果您實驗室的做法是在不使用時保持檢測器開啟。


檢測器波長和采集設置


較低的波長設置 (<220nm) 將顯示噪聲增加，這與溶劑（MeOH 吸收高達 201nm）和緩沖液相關，這會降低落在光電二極管陣列上的光量。探測器的噪聲與落在光電二極管上的光量成反比；因此，任何其他減少落在光電二極管上的光量的因素也會增加輸出中的噪聲。通常，這可能包括老化的燈或臟的流通池窗口。


　　這些問題可以通過以下方式克服：


　　根據制造商的說明清潔或更換流動池窗口
　　執行燈強度測試(使用車載診斷)以評估燈性能，必要時更換燈
　　用乙腈代替甲醇作為有機改性劑(甲醇截止波長為210納米)
　　避免使用高吸收緩沖液和添加劑，包括(括號中顯示了10毫米溶液的紫外截止值)TFA(0.1% TFA在214     納米處的吸光度遠低于210納米、檸檬酸鹽(230納米)、乙酸鹽(210納米)和甲酸鹽(210納米))
　　根據所用溶劑的可壓縮性，泵的可壓縮性和沖程容積被優化以最小化噪音


　　


　　大多數二極管陣列紫外探測器都有一個“狹縫寬度”設置，它描述了光線通過流動池后聚焦在光電二極管上的狹縫寬度。隨著狹縫寬度的增加，光變得更加漫射，并且每個波長落在多個光電二極管(對應于狹縫寬度設置)上。這降低了基線噪聲并增加了信號強度，從而在定量分析物時實現了更高的分析靈敏度。然而，定性分析所需的光譜分辨率(如通過庫匹配進行峰值跟蹤)會丟失，這需要更窄的狹縫寬度設置，因此光的漫射更小，每個波長落在更少數量的二極管上。當狹縫寬度減小時，噪聲水平增加。始終根據分析要求設置狹縫寬度。


　


　　根據以下關系，檢測器采集速率和數據聚集也可能對信號噪聲產生深遠影響


　　檢測器采集速率和數據聚合


　　其中n是數據點數。簡而言之，我們進行的測量越多，就越能更好地模擬與儀器響應變化相關的隨機變化，這意味著可以更有效地解決噪聲問題。仔細平衡信噪比和實際產生的峰峰值噪聲非常重要，這通常通過儀器響應或頻率來實現。這需要與每個峰上收集的數據點數量進一步平衡，對于紫外線數據，數據點數量應在20-25或更高的范圍內。


　　


　　如前所述，紫外線中的氘燈使用壽命有限，因此當燈在金屬外殼上形成電弧到安裝的燈絲時，基線噪音和尖峰會增加。這將產生類似于圖8所示的基線外觀。必須考慮更換燈泡，以確定尖峰是否由燈泡老化引起。請注意，基線尖峰的其他原因也是可能的，例如檢測器中電源或電源板的屏蔽不良。圖8:紫外檢測燈電弧引起的基線尖峰。


　　峰可以與“真實”峰區分開來，因為它們在放大時沒有高斯形狀。


　　其他噪聲源


　　混合不當


　　高效液相色譜紫外檢測器容易受到流動相不正確混合的影響。——這些流動相是通過二元或四元泵系統在線形成的。混合不良引起的吸光度變化通常與正弦脈沖有關(在以后的博客中介紹)。然而，在低泵送能力下或當使用添加劑如TFA時，干擾可能類似于噪聲，而不是可區分的正弦脈沖。


　　圖9:用不同混合器獲得的紫外吸收信號(214納米)的比較。使用與圖5相同的泵，但現在使用色譜柱(30毫米x  2.1毫米內徑安捷倫SB-C18)和梯度洗脫。溶劑A為0.1%三氟乙酸水溶液，溶劑B為0.1%三氟乙酸乙腈溶液，梯度在4分鐘內從2%上升到40% B。[1]


　　


　　雖然現代高效液相色譜儀器設計有高效混合器，但在上述情況下，增加上市后靜態混合器或簡單的在線過濾器可以顯著降低基線噪聲。請注意，安裝在線混合器導致的額外色譜柱體積可能會對峰寬產生不利影響，尤其是在UHPLC系統中。當評估該方法的信噪比特性時，平衡峰值寬度的任何增加和基線噪聲的減少。


　　故障四元泵梯度比例閥可以獲得非常相似的噪聲特性。


　　脫氣不足


　　如果流動相脫氣不良，當洗脫液因壓力變化進入檢測器流動池時，小氣泡可能會從流動相中逸出。盡管檢測器流動池設計有背壓限制，以降低進入流動池時的壓降，但流動相的這種“鼓泡”將導致顯著的基線噪聲，當洗脫液未正確脫氣時，這種噪聲可能無效。


　　


　　確保使用在線脫氣模塊對洗脫液進行正確脫氣，在某些情況下，在安裝到高效液相色譜系統之前，通過真空脫氣。


　　把…弄干


　　如果高效液相色譜柱含有殘留的填充溶劑或與不混溶的溶劑一起使用(例如，在正相模式下)，柱的不當清洗將導致與除濕相關的基線噪音增加。


　　以方法流速平衡色譜柱數小時，以完全沖洗色譜柱中的任何不混溶溶劑。