色譜是一種重要的生物物理技術，可以分離、鑒定和純化混合物的成分，用于定性和定量分析。蛋白質可以根據其大小和形狀、總電荷、表面疏水基團以及與固定相的結合能力進行純化。基于分子特征和相互作用類型的四種分離技術使用離子交換、表面吸附、分配和尺寸排阻機制。其他色譜技術基于固定床，包括柱色譜、薄層色譜和紙色譜。柱層析是最常用的蛋白質純化方法之一。


　　色譜的原理是混合物中的分子被施加到表面或固體上，流體的固定相(固定相)在流動相的幫助下移動時相互分離。對分離過程有效的因素包括與吸附(液-固)、分配(液-固)和親和力相關的分子特征或它們分子量之間的差異。由于這些差異，混合物中的一些組分在固定相中停留的時間更長，它們在色譜系統中移動緩慢，而其他組分快速進入流動相并更快離開系統[。

      
　　基于這種方法，三種組分構成了色譜技術的基礎。

　　固定相：該相總是由“固體”相或“吸附在固體載體表面的一層液體”組成。
　　流動相：該相總是由“液體”或“氣體成分”組成。


　　分離的分子

　　固定相、流動相和混合物中所含物質之間的相互作用類型是有效分離分子的基本成分。基于分配的色譜對于小分子如氨基酸、碳水化合物和脂肪酸的分離和鑒定非常有效。然而，親和色譜(離子交換色譜)在分離大分子如核酸和蛋白質方面更有效。紙色譜用于蛋白質的分離和蛋白質合成的相關研究；氣相色譜法用于分離醇、酯、脂和氨基，并觀察酶的相互作用，而分子篩色譜法特別適用于蛋白質分子量的測定。瓊脂糖凝膠色譜法用于純化核糖核酸、脫氧核糖核酸顆粒和病毒。


　　色譜中的固定相是涂在固相表面的固相或液相。流經固定相的流動相是氣相或液相。如果流動相是液體，稱為液相色譜(LC)，如果是氣體，稱為氣相色譜(GC)。氣相色譜法適用于氣體、揮發性液體和固體物質的混合物。液相色譜特別適用于熱不穩定和不揮發的樣品。


　　除了分離，使用色譜作為定量分析方法的目的是在合適的時間間隔內實現令人滿意的分離。為此已經開發了各種色譜方法。其中包括柱色譜、薄層色譜、紙色譜、氣相色譜、離子交換色譜、凝膠滲透色譜、高壓液相色譜和親和色譜。
     

    色譜類型


　　柱色譜
　　離子交換色譜法
　　凝膠滲透(分子篩)色譜法
　　親和色譜法
　　紙色譜分析法
　　薄色層分離法
　　氣相色譜分析
　　染料配體色譜法。
　　疏水相互作用色譜
　　假親和色譜。
　　高壓液相色譜


　　柱色譜
　　由于蛋白質在大小、形狀、凈電荷、使用的固定相和結合能力方面具有不同的特征，因此這些特征成分中的每一種都可以通過色譜法純化。在這些方法中，最常用的是柱色譜法。這項技術用于純化生物分子。在色譜柱(固定相)上，首先分離樣品，然后使用洗滌緩沖液(流動相)(圖1)。確保它們流過玻璃纖維支架上柱子中的材料。樣品以時間和體積相關的方式積累在設備底部[7]。

      
　　離子交換色譜法


　　離子交換色譜是基于帶電蛋白質組和固體支持材料(底物)之間的靜電相互作用。基質對待分離的蛋白質具有相反的離子負載，蛋白質與色譜柱之間的親和力是通過離子鍵實現的。通過改變緩沖溶液的pH值、離子鹽濃度或離子強度，將蛋白質從色譜柱中分離出來。帶正電荷的離子交換基質稱為陰離子交換基質，它可以吸附帶負電荷的蛋白質。與帶負電荷的基團結合的基質稱為陽離子交換基質，吸附帶正電荷的蛋白質。圖2) [9]。

   
　　凝膠滲透(分子篩)色譜法
       

　　這種方法的基本原理是利用含葡聚糖的材料，根據大分子的大小差異來分離大分子。該程序主要用于測定蛋白質的分子量和降低蛋白質溶液的鹽濃度。在凝膠滲透柱中，固定相由具有小孔的惰性分子組成。含有不同大小分子的溶液以恒定的流速連續通過色譜柱。大于孔隙的分子不能滲透到凝膠顆粒中，它們被限制在顆粒之間。較大的分子穿過多孔顆粒之間的空間，并在柱內快速移動。比孔小的分子擴散到孔中，隨著分子變小，它們離開色譜柱的保留時間成比例地延長(圖3) 。Sephades型是最常用的色譜柱材料。此外，葡聚糖、瓊脂糖和聚丙烯酰胺也用作柱材料。

       
　　親和色譜法
     

　　這種色譜技術用于純化酶、激素、抗體、核酸和特定蛋白質。能與特定蛋白質(葡聚糖、聚丙烯酰胺、纖維素等)形成復合物的配體。)與色譜柱的填充材料相結合。與配體形成復合物的特定蛋白質附著在固體支持物(基質)上并保留在色譜柱中，而游離蛋白質則離開色譜柱。然后結合的蛋白質通過改變pH值或加入鹽溶液來改變其離子強度，從而離開色譜柱(圖4) 。紙色譜分析法


　　紙上的色譜支持材料由一層高度飽和的水纖維素組成。在這種方法中，厚厚的濾紙形成支撐，水滴在其孔隙中沉淀，形成靜態“液相”。流動相由放置在顯影罐中的合適流體組成。紙色譜是一種液-液色譜。


　　薄色層分離法


　　薄層色譜是一種“固液吸附”色譜。在該方法中，固定相是涂覆在玻璃板上的固體吸附材料。用作吸附材料的所有固體物質。可以使用柱色譜(氧化鋁、硅膠、纖維素)。在這種方法中，流動相向上移動通過固定相。并且通過溶劑的毛細作用向上移動到浸透了溶劑的薄板。在此過程中，它還使用移液管以不同的流速向上推動之前落在板下部的混合物。從而實現分析物的分離。這種向上運動的速度取決于材料、固相和溶劑的極性。


　　當樣品分子無色時，可以通過熒光、放射性或特定化學物質產生可見的有色反應產物，以確定它們在色譜圖上的位置。可見顏色的形成可以在室內光或紫外光下觀察到。混合物中每個分子的位置可以通過計算分子和溶劑之間的距離比來測量。測量值稱為相對遷移率，用符號R  . f  . R  . f  .表示.數值用于分子的定性描述。


　　氣相色譜分析


　　在該方法中，固定相是放置在裝置中的柱，其包含吸附在惰性固體表面上的液體固定相。氣相色譜是一種“氣液”色譜。它的載體相由氣體組成，如氦或N  2。惰性氣體流動相在高壓下通過色譜柱。待分析的樣品被蒸發并進入氣態流動相。樣品中包含的成分分散在固體載體上的流動相和固定相之間。氣相色譜是一種簡單、多方面、高靈敏度、應用迅速的技術，可用于極其優異的微小分子分離。它用于分離極少量的分析物。


　　染料配體色譜法。


　　這項技術的發展是基于嘌呤核苷酸，嘌呤核苷酸已經證明許多酶可以結合到汽巴隆藍F3GA染料上。帶負電荷基團的平面環結構與NAD相似。通過證明汽巴隆藍F3GA染料與腺嘌呤和NAD核糖結合位點的結合，已經證實了這種類比。這種染料是腺苷二磷酸核糖的類似物。這種吸附劑的結合能力比其他吸附劑強10-20倍。在合適的酸堿度條件下用高離子強度的溶液洗脫，利用吸附劑的離子交換特性將吸附的蛋白質從柱中分離出來。疏水作用色譜


　　在該方法中，制備作為柱材料的吸附劑用于親和層析中的配體結合。HIC技術是基于側鏈之間的疏水相互作用結合色譜基質。


　　假親和色譜。


　　一些化合物如蒽醌染料和偶氮染料可以用作配體，因為它們對脫氫酶、激酶、轉移酶和還原酶具有親和力。這種色譜最著名的類型是固定化金屬親和色譜(IMAC) 。


　　高壓液相色譜


　　使用這種色譜技術可以在短時間內分析和純化許多分子，在氨基酸、碳水化合物、脂質、核酸、蛋白質和類固醇的分離和鑒定中產生完美的結果和其他生物活性分子。在高效液相色譜中，流動相以10-400個大氣壓和高流速(0.1-5厘米/秒)通過色譜柱。在該技術中，使用小顆粒并對溶劑流速施加高壓可以提高高效液相色譜的分離能力，并在短時間內完成分析。

　　高效液相色譜設備的基本組成部分是溶劑庫、高壓泵、市售色譜柱、檢測器和記錄儀。分離的持續時間在計算機系統的幫助下被控制，并且材料被累積[25]。


　　色譜在醫學中的應用領域。

　　色譜對生物化學家來說是一個有價值的工具。此外，它可以很容易地應用于在臨床實驗室進行的研究。例如，紙層析被用于鑒定體液中與遺傳代謝紊亂相關的某些類型的糖和氨基酸。氣相色譜法用于在實驗室中測量類固醇、巴比妥酸鹽和脂類。色譜法也被用來分離維生素和蛋白質。


　　結論

　　最初，色譜被用來根據顏色分離物質，就像草藥色素一樣。隨著時間的推移，其應用領域得到了極大的拓展。目前，色譜法被認為是一種極其靈敏和有效的分離方法。柱色譜是一種有用的分離和測定方法。柱層析是根據蛋白質的特性實現的蛋白質純化方法。此外，這些方法用于控制蛋白質的純度。高效液相色譜具有許多優點，尤其是靈敏度高、周轉快。它可以作為一種定量方法來純化氨基酸、蛋白質、核酸、碳氫化合物、碳水化合物、藥物、抗生素和類固醇。