許多使用細胞的生物學應用，例如微生物學、細胞培養和血液工作，都要求我們確定實驗的細胞濃度。細胞計數實際上非常簡單，需要一個稱為血細胞計數器的計數室，這是一種由 19 世紀法國解剖學家發明的用于進行血細胞計數的設備。


       血細胞計數器由厚玻璃顯微鏡載玻片組成，中間刻有垂直線網格。網格具有指定的尺寸，因此可以知道線條覆蓋的區域，這使得計算特定體積溶液中的單元格數量成為可能。最常見的血細胞計數器在中間刻有一個“H”形，包圍著兩個獨立的鏡面拋光網格表面，并提供蓋玻片安裝區域（圖 1）。在這里，我們將向您介紹如何使用血細胞計數器并準確計算您的細胞濃度。


通過四個簡單的步驟使用血細胞計數器
1. 用臺盼藍稀釋樣品
臺盼藍是一種染色劑，可讓您區分死細胞和活細胞。當與您的細胞樣本混合時，任何死細胞都會被染料染成藍色，這意味著您只能計算那些活的和有活力的細胞。您可以使用任何比例的臺盼藍稀釋樣品，但 1:1 的比例是最常見的。無論您使用何種稀釋度，請務必記下它，因為您在最終計算時需要用到它。


2. 加載血細胞計數器
在開始之前，請使用鏡頭紙清除所有灰塵顆粒，以確保血細胞計數器及其蓋玻片都是干凈的。用于安裝在血細胞計數器上的蓋玻片專門制成比傳統顯微鏡蓋玻片更厚，因為它們必須能夠克服一滴液體的表面張力。在裝入細胞懸液之前，請確保將蓋玻片放在計數表面上。然后將帶有樣品的移液器吸頭放入其中一個 V 形孔中，輕輕排出樣品。蓋玻片下的區域通過毛細作用填充。


應引入足夠的液體，以便剛好覆蓋鏡面，通常約為 10 μl，但不要過度填充表面。您可以在一個血細胞計數器上加載兩個樣本，兩個網格中的每一個都加載一個。然后將加載的血細胞計數器放置在顯微鏡載物臺上，計數網格以低功率聚焦。讓樣品靜置幾分鐘，避免移動蓋玻片，因為它可能會引入氣泡并使計數變得困難。


3. 在血細胞計數器中計數細胞
血細胞計數器上的完整網格包含九個正方形，每個正方形為 1 mm 2。血細胞計數器的中心計數區包含 25 個大方格，每個大方格有 16 個小方格。在計算與外線或標線重疊的單元格時，僅計算大正方形頂部或右側線上的單元格，以避免將單元格計數兩次。懸浮液應足夠稀釋，使細胞或其他顆粒不會在網格上相互重疊，并且應均勻分布。


要進行計數，請確定識別所需細胞類型所需的放大倍數，并系統地對所選方塊中的細胞進行計數，以便總計數約為 100 個細胞，這是統計顯著計數所需的最少細胞數。對于大單元格，您可以簡單地計算四個大角方塊和中間方塊內的單元格。對于小細胞的密集懸浮液，您可能希望對中心正方形的四個外部和中間正方形中的細胞進行計數，或者制作更稀的懸浮液。


請記住，如果一個單元格與一條線重疊，如果它與頂部或右側線重疊，則將其計為“入”，如果與底部或左側線重疊，則將其計為“出”（圖 3F）。中間（圖 3A）和每個角方塊（圖 3B-E）的面積為 1 mm x 1 mm = 1 mm 2。每個正方形的深度為 0.1 毫米。因此，該深度處每個方塊的最終體積為 100 nl。


4. 計算細胞濃度
您可以使用以下公式計算細胞濃度：


總細胞數/ml =（計數的總細胞數 x 稀釋因子 x 10,000 個細胞/ml）/ 計數的方塊數


因此，例如，如果您用臺盼藍按 1:1 稀釋樣品（在這種情況下稀釋因子為 2），并且您在四個角正方形加上中央大正方形（計數的正方形數為 5）中計數了 325 個細胞，然后：
 
總細胞數/ml = (325 個細胞 x 2 x 10,000 個細胞/ml)/ 5 = 130 x 10 4 個細胞/ml


如果您想知道原始樣品中有多少細胞，只需將細胞濃度乘以總樣品體積即可。例如，如果您的原始樣品體積為 5 ml，則：


樣品中的總細胞數 = 130 x 10 4 個細胞/ml x 5 ml = 650 x 10 4 個細胞


就是這樣！一旦您了解了使用血細胞計數器的基礎知識，細胞計數真的就像 1、2、3 一樣簡單！我們很想聽聽您的任何細胞計數技巧；在評論中給我們留言。