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液相色譜儀的檢定
JJG 705-2014液相色譜儀檢定規程(以下簡稱新規程) 由國家質量監督檢驗檢疫總局于2014年2月14日頒布, 并于同年8月14日正式實施, 用以替代JJG 705-2002液相色譜儀檢定規程。
工作原理
液相色譜儀由輸液系統 (包括輸液泵、流動相儲器和梯度儀) 、進樣系統、分離系統 (包括色譜柱和柱恒溫器等) 、檢測系統和數據處理系統等組成。流動相被高壓泵打入系統中, 混合樣品溶液由進樣系統注入, 跟隨流動相流入色譜柱。由于混合樣品中不同組分在固定相和流動相間的吸附與分配系數不同而產生不同的運動速度, 經多次吸附-解析過程逐步分離, 由流動相帶入檢測器中, 并轉換成電信號輸送至記錄儀, 以色譜圖形式輸出, 進行定性或定量分析。
檢定方法
新規程在后續檢定中主要考察儀器以下幾項技術指標。
泵流量穩定性SR
將儀器各部分連接好, 流動相用100%甲醇, 通過工作站或儀器操作面板設置檢定流量 (如表1所示, 選擇高、中、低三檔流量逐一測定) , 啟動儀器, 待壓力穩定后, 在流動相出口處用容量瓶 (空瓶質量為W1) 收集流出液, 并同時用秒表計時t。在經檢定合格的分析天平上稱重, 質量為W2, 按式 (2) 、 (3) 計算實際所測流量值Fm, 重復三次, 得三次實測流量平均值, 按式 (1) 計算SR。SR為三檔流量中最大值。
其中ρt為經溫度校正后的甲醇密度, T為測定流速時溫度。
表1 泵流量設定值和收集時間
選用100%甲醇為流動相, 流速定為1.0 m L/min, C18色譜柱, 開啟儀器, 基線穩定后記錄30 min, 讀取瞬時最大基線峰-峰高值, 再乘以檢測器衰減倍數得到基線噪聲 (Nd) , 30 min內基線偏離起始點的最大值為基線漂移, 均用儀器自身物理量表示。不同檢測器自身物理量和檢定條件如表2所示。
表2 檢測器自身物理量和檢定條件
檢定條件同2.2, 記錄進樣量V為10~20μL標準物質 (表3) 所得色譜圖, 積分得色譜峰高H, 根據式 (4) 計算最小檢測濃度CL。
檢定條件同2.2, 注入一定體積標準物質 (表4) 得色譜圖, 積分得色譜峰保留時間 (用于定性) 和峰面積 (用于定量) , 重復6次, 根據式 (5) 分別計算定性、定量重復性。
檢定規程解讀
1) 泵流量誤差檢定中, 新規程增加了不同溫度下流動相密度的折算公式, 引入了溫度校正系數 (0.000 93 g/cm3·℃-1) , 減小了由溫度變化引起的誤差。但甲醇具有一定揮發性, 所以每次收集完流動相, 應迅速蓋上瓶塞及時稱重, 且三次計時和收集流出液應配合熟練, 盡量降低人為誤差對泵流量穩定性的影響。
2) 基線穩定性是儀器性能好壞的一項重要指標, 液相色譜儀系統中若有未被排出的氣泡則會引起譜帶展寬, 干擾檢測器正常工作, 影響基線穩定, 使噪聲偏大, 因此在運行檢定之前應先充分脫氣, 并用流動相沖洗泵和檢測器。
3) 新規程中所有檢測器的性能檢定均使用100%甲醇作為流動相。色譜級甲醇是實驗室中易得的常用試劑, 針對多個檢測器串聯的儀器使用相同的流動相可避免在切換檢測器進行檢定時重新脫氣、沖洗系統, 大大縮短了檢定時間。
4) 原JJG 705-2002中熒光檢測器和示差折光率檢測器在檢定時分別選用的標準物質為硫酸奎寧/高氯酸水溶液和丙三醇/水溶液, 但在檢定過程中發現這兩種標準物質的峰型較差, 不可避免存在裂峰, 且經常伴有一些雜峰難以區分, 重現性較差, 給檢定帶來一定困難。熒光檢測器是利用化合物具有光致發光性質, 受紫外光激發, 能發射比激發波長較長的熒光對組分進行檢測, 因此需要化合物中具有能夠產生熒光的不飽和共軛鍵, 新規程采用萘-甲醇溶液標準物質出峰利落, 且對稱性較好, 可達到良好的分析效果。
5) 蒸發光散射檢測器是新規程中新增的檢測器。在以往的校準工作中筆者一般采用85%甲醇/水作流動相, 糖柱, 葡萄糖為標準物質進行校驗, 峰型清楚, 且重現性較好。新規程中采用膽固醇-甲醇溶液作為檢定用標準物質, 可直接使用C18柱, 且流動相中沒有水的存在, 大大減小了對儀器本底造成的影響。
6) 選用膽固醇-甲醇溶液作為示差折光率檢測器和蒸發光散射檢測器檢定用標準物質時, 會在進樣初期出現倒峰, 特別是對示差折光率檢測器來說, 膽固醇的響應值較低, 影響到整機性能的檢定。由于定性重復性和定量重復性是根據6次進樣的相對標準偏差得到的, 是一個統計的概念, 與進樣量無關, 因此可以適當增加進樣量以利于積分。
規程的主要修訂內容及主要技術關鍵
主要修訂內容:增加了蒸發光散射檢測器的檢定內容, 同時將舊規程中熒光檢測器檢定用標準物質由硫酸奎寧-高氯酸水溶液改為萘-甲醇溶液, 將示差折光率檢測器檢定用標準物質由原來的丙三醇-水溶液改為甲醇中膽固醇溶液標準物質等。下面對修訂的相應內容進行具體介紹及解釋:
增加了引言內容
根據JJF1002-2010《國家計量檢定規程編寫規范》的規定, 引言內容為必備章節, 主要列出了與舊規程相比較的主要技術變化, 所替代規程的歷次版本發布情況等。
蒸發光散射檢測器的檢定
本次修訂增加了蒸發光散射檢測器的檢定內容, 并且根據對不同廠家生產的不同型號的新、老儀器進行實驗, 同時與生產廠家的技術人員和用戶單位實驗人員進行多次溝通、討論, 反復征求各方面專家意見后制定蒸發光散射檢測器的各項檢定技術指標 (見表1) , 并通過實驗數據證明了其合理性和可行性。
熒光檢測器檢定
用標準物質由硫酸奎寧/高氯酸水溶液修改為萘-甲醇溶液標準物質。
舊規程中熒光檢測器檢定用標準物質為硫酸奎寧-高氯酸水溶液, 由于硫酸奎寧為水溶性, 因此在檢定過程中為了增加洗脫能力需要在流動相中加一定量的水。即便如此, 由于儀器的各種原因, 經常出現信號不理想等情況, 導致檢定不能順利進行。根據實驗和以往經驗, 本次修訂中將其改為萘-甲醇溶液標準物質, 并通過實驗驗證, 避免了上述問題的出現。若檢定中同時有紫外或二極管陣列檢測器, 可以不改變流動相的組成, 甚至可以同熒光檢測器串聯在一起進行檢定, 提高了檢定效率。
示差折光率檢測器檢定
用標準物質由原來的丙三醇-水溶液修改為甲醇中膽固醇溶液標準物質。
舊規程中示差折光率檢測器檢定用標準物質為丙三醇-水溶液, 但由于其穩定性的原因至今未申報國家有證標準物質, 不符合量值溯源要求。經過實驗證明, 膽固醇-甲醇溶液完全可以替代之, 并且使得兩種通用型檢測器 (示差折光率檢測器和蒸發光散射檢測器) 使用同一種標準物質, 既方便使用又減少檢定成本。
刪除檢測器換擋誤差的檢定
舊規程中對檢測器換擋誤差的檢定是為了滿足以記錄儀為數據處理器的液相色譜儀的需求, 而隨著近年來儀器突飛猛進的發展, 以記錄儀為數據處理器的液相色譜儀已經逐漸被淘汰, 因此, 本次修訂不再保留該項檢定內容。
表5 蒸發光散射檢測器的主要技術指標
表6 檢測器最小檢測濃度指標變化
表7 修訂的檢定項目
修訂了部分檢定項目的技術指標
(1) 整機定性重復性由原來的1.5%修改為1.0%。
(2) 檢測器基線噪聲和漂移采集時間由原來的1h改為30min。
(3) 檢測器最小檢測濃度的指標變化如表2所示。
修訂了檢定項目一覽表 (見表7)
增加了梯度參考程序
為了方便對泵梯度誤差的檢定, 增加了梯度參考程序供參考使用。
以上就是關于液相色譜儀的所有檢定。
