對于初學者來說，分析液相色譜儀方法可能會讓人不知所措。此類方法通常包含與實驗中每個步驟相關的信息和說明。熟悉實驗室中液相色譜儀方法的格式很重要，這樣您就可以輕松找到整個過程的方法。

對液相色譜儀器進行設置

       準備好一臺液相色譜儀器、色譜柱和化學品，下一步就是開始設置您的儀器進行測試。檢查液相色譜儀器的校準狀態非常重要。所選儀器必須成功通過所有校準測試；這通常由儀器上的貼紙或標簽指示，說明上次和下一次校準的結果和日期。進行校準測試以確保儀器的每個部分都在適當的范圍內工作。例如，必須檢查泵的流量以匹配數字輸入；對檢測器、進樣器和色譜柱加熱器進行了類似的測試。目的是確保實驗室中的所有儀器都能正常工作并且在預定的誤差范圍內。

       選擇儀器后你必須對其進行清潔并準備色譜柱。清潔步驟對于去除之前工作中的任何殘留物很重要；因此可以獲得穩定的基線和準確的結果。許多方法規定了在測試之前清洗系統的特殊順序。通常，清潔程序包括先用流水去除任何緩沖液殘留物，然后再用純甲醇或異丙醇/甲醇混合物。最后，將 50% 的有機溶液沖洗通過系統。最終沖洗液的組成很大程度上取決于所使用的色譜類型：反相或正相。還根據色譜柱的類型和要使用的流動相的組成對色譜柱進行沖洗。查閱色譜柱的宣傳單以確定適合您的色譜柱的最佳沖洗和儲存解決方案。


用于液相色譜儀測試的溶液的制備

       首先要制備的溶液通常是流動相。有時，當使用梯度系統時，您需要為您的分析方法制備多個流動相。使用液相色譜儀級水和溶劑來制備流動相非常關鍵。準備好流動相后，就可以開始用相應的溶液沖洗系統并開始平衡色譜柱了。大多數 HPLC 系統本質上是四元系統，即可以從四個不同的入口管線泵送。如果要使用多條管線（即該方法涉及梯度），那么通過每條管線沖洗的最終溶液應該是與流動相兼容的溶劑。

      例如，如果流動相的緩沖液含量高，則入口管線必須用至少 50% 的沖洗水溶液沖洗，以防止流動相中的鹽析出并堵塞入口管線。所有沖洗液和流動相都應通過微過濾器（0.45 μm 或 0.2 μm）過濾以去除細菌和有機碎片。

      沖洗系統并開始平衡色譜柱后（在某些情況下可能需要 3 小時或更長時間，具體取決于色譜柱類型和流動相組成），您應該開始處理樣品和參考溶液。在許多情況下，您在制備這些溶液時需要采取特殊的預防措施，例如減少暴露在光線或濕氣中的時間，以防止分析物降解并產生錯誤結果。這些特殊的注意事項通常會在分析方法中提及。參考溶液和樣品溶液也應通過稱為注射器過濾器的特殊過濾器進行過濾（因為它們安裝在注射器上）。但是，所用過濾器的類型和材料應與分析物和溶劑兼容，以避免吸附或污染。

處理色譜圖并計算出結果

       一旦您確定您的系統工作正常，請恢復進樣順序以進樣樣品溶液。完成序列后，您可以使用特定軟件對采集的色譜圖進行處理，從而得出有意義的結果。一些軟件程序允許您“整合”所有峰，無論它們有多小。計算每個峰下的面積，并使用生成的數字來確定測試結果。液相色譜儀實驗后有兩種主要的計算方式：首先，通過使用測定來確定一種或多種活性成分的含量，例如計算片劑中撲熱息痛的含量。或者，您可能希望確定色譜圖，即確定雜質的類型及其相對比例。在您輸入分子量和稀釋因子后，當前的軟件可以進行計算并生成最終報告。